Biyoinformatik dünyasına kaliteli, özgün ve Türkçe içerikler kazandırmayı hedefleyen bir platform..

Polimeraz zincir reaksiyonu (polymerase chain reaction, PCR), herhangi bir organizmaya ait DNA’daki istenen bölgelerin enzimatik olarak çoğaltılmasını sağlayan yöntemdir.

Genetik bilgiyi analiz etmek oldukça büyük miktarda DNA gerektirir, bu yöntem basitçe In vitro koşullarda belirli DNA parçasının enzimatik olarak kopyalanması ve çoğaltılması yöntemidir.1985 yılında Kary Mullis tarafından geliştirilen bu teknik, 1993 yılı Nobel Kimya Ödülünü kazandırmıştır. Bakterilere gereksinim duyulmadan replikasyona olanak tanıması sayesinde moleküler biyoloji, genetik mühendisliği, mikrobiyoloji ve daha birçok dalda giderek genişleyen bir kullanım alanına sahiptir.

PCR testinin kullanım alanları nelerdir?

PCR, DNA araştırmalarında, adli tıpta ve genetik hastalık teşhisinde yaygın olarak kullanılmaktadır, önemli kullanım alanları:

1. DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında
2. Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı
3. Adli tıpta
4. Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması
5. Nokta mutasyonlarının belirlenmesinde
6. Onkogenezin (kanser oluşumu, nedenleri) araştırılmasında
7. PCR kaynaklı RAPD, AFLP, SSR ve ISRR gibi birçok bitki ve hayvanda genetik akrabalığın teşhisinde kullanılan teknikler geliştirilmesi
8. Babalık testi

PCR 3 ana aşamadan oluşur:

1) DNA Zincirinin Açılması-Denatürasyon (Denaturation)

Kalıp DNA (template DNA), 92-95 derecede 1-2 dakika tutularak çift sarmal yapıdaki DNA iplikçikleri birbirlerinden ayrılmaktadır. DNA zincirini ayırmak için, bazı durumlarda 5-10 dakika ön ısıtma yapmak gerekebilir.

2) Primerlerin Açılan DNA Zincirlerine Yapışması-Bağlanma (Annealing)

Reaksiyon sıcaklığının, 37-65 dereceye düşürülerek oligonükleotid primerlerinin açılan DNA zincirlerinin kendi baz dizilerine karşılık gelen bölgeye yapışması işlemidir. Bu işlem, üretilecek baz uzunluğuna bağlı olarak saniyede gerçekleşmektedir.

Primer Uzaması-Uzama (Primer Extesion)

DNA zincirleri üzerine yapışan primerlerin DNA polimeraz enzimi (Taq DNA polymerase) vasıtasıyla uzatılmasıdır. Taq DNA polymerase 72 derece sıcaklıkta daha iyi çalıştığı için genel olarak tüm çoğaltma işlemleri bu sıcaklıkta yapılmaktadır.

PCR, genel olarak 25 ile 40 defa tekrar edilerek başlangıçtaki DNA dizisinden milyonlarca yeni DNA parçacığı çoğaltılır.

PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile çalışmaya olanak sağlamaktadır. PCR tekniği ile laboratuvar tanısında çok büyük bir hız ve kesinlik kazanılmış; birçok durumda radyoaktivite kullanımını gereksiz hale getirmiştir. PCR belirli bir geni çoğaltmak için oldukça iyi bir araç olmakla birlikte, birden fazla gene ait çalışmaları PCR ile gerçekleştirdiğinizde DNA dizileme maliyetinin ve hata oranlarının fazla olması gibi sorunlar yeni nesil dizileme teknolojisini doğurmuş ve birçok araştırmacıyı PCR makineleri ve yöntemlerini modernize etmelerini sağlamıştır.

Kullanılan Malzemeler

1. Distile su
2. Buffer (tampon çözeltisi-1XTBE) ve MgCl2
3. Dinükleotittrifosfatlar (dNTP)
4. Primerler (forward ve reverse)
5. Taq DNA polimeraz
6. Çoğaltılmak istenen DNA (kalıp-template DNA)

1976 yılında, Cincinnati Üniversitesinden bir grup araştırmacı kaplıca ya da hidrotermal bacalarda yaşayan termofilik bir bakteri olan Thermus aquaticus bakterisinden Taq polimeraz enzimini keşfetti. Taq polimeraz enzimi, PCR'da kullanılan, yüksek sıcaklıklara (94 °C) ve denatürasyon sıcaklıklarına dayanabilen bir enzimdir.

Real-Time PCR nedir?

Işıma özelliğine sahip moleküller kullanarak PCR’ı oluşurken izleme ve miktar belirleme yöntemidir. Real-Time PCR, Quantitative veya qPCR olarak da adlandırılır. Bir genin o hücredeki ekspresyon seviyelerini ölçmek için RT-PCR yapılır.

Real-Time PCR ne için kullanılır?

PCR'ın önemli dezavantajları hız ve kontaminasyondur ancak Real-Time PCR bu dezavantajları ortadan kaldırır.

1. Gen ekspresyon analizlerinde(kanser ve ilaç araştırmasında), ilaç endüstrisi, onkolojik çalışmalar
2. Hastalık Teşhisinde(virüs miktarının saptanmasında)
3. Gıda Testlerinde(gıdalarda bulunan GDO yüzdesini saptamada)
4. Genotipleme
5. Patojen Tespiti
6. DNA hasarı
7. Adli tıp
8. Doğum öncesi

Örneğin: Bir koronavirüsün var olup olmadığına değil de ne kadar var olduğuna bakmak istersek işte burada Real-Time PCR devreye girecektir. Normal PCR'ın exponential(üssel) şekilde arttığını unutmayalım. Yani DNA'nın yalnızca bir kopyası ile başlarsanız 5. döngüde 2⁵=32 kopyanız olacaktır. Eğer 10 kopya ile başlarsanız, prensip olarak 35 döngüden sonra DNA'nın 300 milyardan fazla kopyasına sahip olacaksınız. Eğer 10.000 kopya ile başlarsanız, 35.döngüden sonra 300 trilyon şablon kopyasına sahip olacaksınız. Öyleyse neden PCR reaksiyonunun sonuna bakıp hangi numunede daha fazla DNA olduğunu görmüyorsunuz? Sorun şu ki PCR reaksiyonu bu kadar DNA üretmeden nükleotidleri tüketir. Aslında doğru olan şudur: Sonunda her iki numune de aynı miktarda DNA'ya sahiptir. Ancak başlangıç miktarı fazla olan numune daha fazla DNA'yı daha hızlı yapmıştır.

Real Time PCR'ın yaptığı şey her döngüden sonra tüpteki DNA miktarını gerçek zamanlı olarak izlemektir. Örneklerin eğrilerini bilinen miktarda şablon DNA'nın eğrisiyle karşılaştırarak ne kadar DNA ile başladığını bilebilirsiniz. Bu yüzden gerçek zamanlı PCR'a kantatif veya qPCR denir.

Kısa bir not: standart bir PCR termocycler kullanarak gerçek zamanlı PCR yapamazsınız çünkü her döngüden sonra ne kadar DNA bulunduğunu izlemenin bir yolu yoktur. Bu nedenle gerçek zamnlı PCR yapmak için bilim insanları, normal PCR makinesi gibi ısıtılıp soğutulabilen, ancak aynı zamanda her döngüden sonra PCR örneğinin floresansını ölçebilen afilli bir makine kullanır.

Reverse Transcription PCR(RT-PCR)

Reverse Transcription PCR, şablon olarak DNA değil, RNA alır. Öncelikle RNA'yı cDNA'e çevirmemiz gerekir.