Biyoinformatik dünyasına kaliteli, özgün ve Türkçe içerikler kazandırmayı hedefleyen bir platform..

Gen düzenleme kavramı yıllar boyunca bilim insanlarının büyük ilgisini çekmiştir. Çünkü genom üzerinde bir değişiklik yapma imkanı, belki bir hastalığı iyileştirme seçeneği sunuyor olabilirdi. Günümüzde en popüler gen düzenleme teknolojisi olan CRISPR öncesinde restriksiyon enzimleri ile bazı DNA bölgelerini tanıyıp kesme imkanımız vardı, ancak söz konusu insan genomu olunca(çok uzun) ve çok fazla yeri kesince kontrol dışına çıkıyor ve fazla bir başarılı bir sonuç vermiyordu. Daha sonra ZFN(Zinc Finger Nuclease-DNA'yı el gibi tutan proteinler) bulundu ve daha sonra TALEN bulundu. 2012 yılına kadar bu teknolojiler konuşulurken, en son olarak CRISPR ortaya çıkmış ve daha popüler hale gelmiştir.

Genom Düzenleme Çeşitleri - Yeni Nesil Genom Düzenleme Teknikleri:

1. ZFN
2. TALEN
3. CRISPR
4. Meganükleazlar

ZFN, TALEN ve CRISPR’lar DNA’da hedeflenen bölgeye bağlanabilmeleri sayesinde genomda düzenleme yapmaya imkân veren yeni nesil genom düzenleme teknikleridir. Bu tekniklerin kullanımı sayesinde hedef genler mutasyona uğratılarak ya da genomdan kesilerek susturulabilmekte, ayrıca genlerde istenilen nükleotidlerin değiştirilmesi de mümkün olabilmektedir. Bu nükleazlar DNA kesim (restriction) enzimlerine benzer şekilde, genomda düzenleme yapılmak istenen bölgede DNA’yı çift iplikli olarak keserler. Yapılan genom düzenlemeleri hâlihazırda kullanılan metotlara kıyasla daha hızlı, daha kolay, etkin ve ucuzdur.

Neden Genom Düzenleme Yapılır?

Canlı DNA'sındaki çeşitli mutasyonlar, bazı genetik hastalıklara neden olabiliyor bu nedenle bilim insanları bu genom üzerinde çeşitli değişiklikler yaparak bu hastalıklara çözüm bulmak istiyorlar. Ayrıca istenilen özelliklerin bir canlıya kazandırılması ya da istenmeyen bir özelliğin bir canlıdan çıkarılması amacıyla özellikle bitkilerde de genom düzenleme çalışmaları yapılmaktadır.

Genom Düzenlemeyle İlgili Terimler

1. ZFN
2. TALEN
3. CRISPR
4. Cas9 proteini
5. HNH ve RuvC[Cas9 domayinleri- Çift sarmallı DNA'yı parçalayan Cas9'un alanları, 3 baz sonrası için kesim yapar]
6. sgRNA (single guide RNA- gRNA)
7. PAM sekansı(Protospacer adjacent motif- Protospacer bitişik motif-cas9 için bağlanma sinyali olarak işlev gören kısa bir DNA dizisi)
8. HR (Homologous Recombination = Homolog Rekombinasyon)[Hücre DNA tamir mekanizması]
9. NHEJ (Non-Homologous End Joining= Homolog Olmayan Uçların Birleşmesi)[Hücre DNA tamir mekanizması]

ZFN ve TALEN ise CRISPR'dan daha önce kullanılan CRISPR alternatifi gen düzenleme teknikleridir, ancak CRISPR 2013 yılında daha popüler hale gelmiştir.

CRISPR Nedir?

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats - Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar).

CRISPR Tekniği, virüslerin bakterilere saldırması ve bakterilerin virüslere karşı kullandığı savunma sisteminin çalışma mantığını, bilim insanlarının fark edip öğrenmesi ile, yine bakterilerden elde edilen çeşitli enzimleri kullanarak başka canlıların genomları üzerinde, özellikle hastalıkların tedavisi için veya istenilen özelliklerin eklenip çıkarılabildiği canlılar elde etmek hedefiyle kullandıkları bir çeşit popüler genom düzenleme tekniğidir.

CRISPR aslında bakterilerin bağışıklık(savunma) sistemidir. CRISPR'ın hikayesi , bakterilerin virüslerden korunmak için kullandığı kazanılmış bir bağışıklık(savunma) sisteminin keşfi ile başlar. Bakterilerin, daha önce karşılaştığı, savaştığı ve yendiği virüslerin genlerini, kendi DNA'sında CRISPR dizisi içinde sakladığı keşfedilmiştir[immünolojik hafıza]. Bakteriye bir virüs saldırısı olduğunda, bakteri, bu yeni virüsün genini daha önce kendi CRISPR dizisi  içine eklediği genler ile karşılaştırır, eğer eşleşme varsa bu defa bakteri, virüs DNA'sını keserek etkisiz hale getirir.

20. yüzyılın sonlarında bilim insanları, bakteriyel genomda değişken DNA sekansları ile ayrılmış bazı gizemli palindromik tekrarları keşfettiler. Palindromik dizi baştan ve sondan okunduğunda aynı sonucu veren dizilerdir. MADAM kelimesi gibi, sağdan ve soldan okununca aynı sonucu verir.

Tekrarlar ilk Ne Zaman Bulundu?

1987 yılında Ishino ve çalışma grubu tarafından E. coli bakterisinde alkalin fosfataz izozim dönüşümünden sorumlu iap geni klonlanıp dizilenmiştir. Araştırıcılar iap geninin aşağı yönünde 29 nükleotidlik bir dizi tekrarının, tekrarsız ve benzer şekilde kısa dizilerle ("spacer") ayrıldığını gözlemlemişler ve sonraki çalışmalarda bu dizileri dizilemişlerdir. Daha sonra, birçok araştırıcı tarafından birçok bakteri ve arkelerde de benzer tekrarlar görülmüştür. 2002 yılında ise bu diziler CRISPR olarak adlandırılmıştır. İlerleyen yıllarda bu tekrar elementlerinin bitişiğinde kümelenmiş Cas genleri tanımlanmıştır. 2005 yılında ise bu dizilerin bakteri genomuna nasıl entegre olduğu ve doğal süreçteki işlevleri ile ilgili mekanizmalar kısmen anlaşılmıştır.

Bu sistemlerde, CRISPR array, "spacer" biçiminde immünolojik hafızayı depolamaktadır. Spacer’lar; istila eden patojenlerden kökenlenen kısa DNA dizileri olup CRISPR DNA tekrarlarının arasında bulunmaktadır. Bir dizi Cas proteini de, CRISPR–Cas sistemlerinin sonradan kazanılmış bağışıklık işlevini meydana getirmesinden sorumludur.

CRISPR Nasıl Çalışıyor?

1. DNA'da kesim yapacak bir molekül olarak Cas9 enzimi kullanılır.
2. Cas9 kesim enzimini, düzenleme yapılacak olan bölgeye götürmesi için rehberlik edecek bir RNA molekülü gerekir. Bu molekülün adı sgRNA (single guide RNA- gRNA)
3. Cas9 proteini ve sgRNA birlikte ilgili genom bölgesine giderler.
4. DNA'da onarım yapılacak yere gittiklerinde eğer burada PAM dizisi varsa kesim sinyali alınır ve DNA üzerinde düzenleme işlemi başlar. PAM dizisi yoksa kesim işlemi başlamaz.
5. DNA kesim işlemi bittikten sonra DNA'nın onarılması gerekir, Bu arada NHEJ ve HR(Hücre DNA tamir mekanizması) devreye girer ve DNA onarımı tamamlanır.

CRISPR-CAS9 Bağlantısı

CRISPR, kesim enzimi olarak Cas9 enzimini kullanmaktadır. Cas9, bakteriden alınmış(Streptococcus pyogenes), RNA ile hedefine giden ve DNA'yı kesen bir endonükleazdır.

"Hangi organizmayla ilgilenirseniz ilgilenin, eğer genomu CRISPR DNA’sı içeriyorsa, hemen yakınında mutlaka Cas genleri vardır. Sanki CRISPR, Cas genleriyle birlikte evrimleşmiş" diyor Jennıfer Doudna.

Cas9 enzimi ayrıca birden fazla DNA dizisini hedefleyebilmekte ve bu protein çok fazla içi tek başına yapabilmektedir.

sgRNA

Cas9 kesim enziminin genomun belirlenen bölgesine gidebilmesi için ihtiyacı olan rehber bir RNA molekülü kullanılır. Yani Cas9 ve gRNA bir kompleks oluştururlar. Mikroorganizmalardaki orijinal CRISPR sisteminde Cas9 proteinine rehberlik eden crRNA ve tracrRNA olmak üzere iki CRISPR RNA’sı bulunur. Genom düzenlemede kullanılan yeniden programlanmış CRISPR sisteminde ise crRNA’nın 3' bölgesi ile tracrRNA’nın 5' ucunun birleştirilmesiyle meydana getirilen sgRNA (single guide RNA) olarak adlandırılan tek bir RNA söz konusudur. sgRNA’nın yaklaşık 20 nükleotidlik kısmı genomdaki hedef DNA sekansı ile complimenterdir.

PAM Dizisi

Cas9/sgRNA kompleksinin DNA üzerinde kesim yapabilmesi için tek ön koşul hedef bölgenin 3' ucunda PAM ismi ile adlandırılmış bir NGG sekansının bulunmasının gerekliliğidir. Eğer PAM dizisi yoksa Cas9 aktive olmaz, eğer PAM dizisi varsa Cas9 DNA'yı kesebilir.

NHEJ ve HR(Hücre DNA tamir mekanizması)

DNA'yı kestikten sonra onarılması gerekir, bunun için hücre DNA tamir mekanizması olarak NHEJ ve HR kullanılır.

NHEJ ve HR’yi birbirinden ayıran temel fark, tamir için DNA homolojisine ihtiyaç duyulup–duyulmadığıdır. DNA replikasyonu sırasında kardeş kromatitler birbirine yakın olduğu için replikasyon sırasında meydana gelen çift iplik kesikleri genellikle HR yoluyla onarılır. Radyasyon gibi çevre faktörlerinin yol açtığı çift iplik kesikleri ise çoğunlukla NHEJ ile tamir edilir. NHEJ'de HR gibi DNA’nın onarımında görevlidir ve genom bütünlüğünün korunmasını sağlamaktadır.

NHEJ ile gerçekleşen tamir ile gen knockoutları oluşurken, HR mekanizması yoluyla da genoma parça entegrasyonu (gene targeting) gerçekleştirilebilir.

ZFN

ZFN(Zinc Finger Nuclease-DNA'yı el gibi tutan proteinler) bulundu ve FokI kesim enzimini kullanmaktadır. FokI, Flavobacterium okeanokoites bakterisinden izole edilen bir kesim enzimidir. ZFN'deki sorun ise sadece 3 tane proteini tanımasıydı.

ZFN(Zinc Finger Nuclease - çinko parmak nükleazlar) 3 nükleotide bağlanır ve kullanımları zordur. ZFN’ler (Zinc Finger Nucleases) kullanıcının genomda modifiye etmek istediği bölgeye göre dizayn edilen ilk dizi spesifik nükleazlardır.

TALEN

TALEN(Transcription Activator Like Effector of Nuclease - transkripsiyon aktivatör-benzeri efektör nükleazlar), her nükleotide sıra ile bağlanır.

TALEN'de kesim enzimi olarak FokI kullanmaktadır. TALEN ise tek nükleotid üzerine çalışıyordu ve kısmen daha kolaydı.

Ekonomik öneme sahip çeşitli bitkilerde hastalıklara dayanıklılık kazandırılarak verimin artırılması için TALEN teknolojisinin kullanımı bilimsel çalışmalarla ortaya konulmuştur.

Hastalıkların Tedavisinde CRISPR Kullanımı

HIV virüsü, göz hastalıkları(kalıtsal bir hastalık olan renk körlüğü vb.), kanser, orak hücre anemisi gibi hastalıkların tedavisi için çalışmalar sürmektedir.

Bitkilerde CRISPR Kullanımı

Bugüne kadar birçok bitkinin genomu CRISPR teknolojisi kullanılarak modifiye edilmiştir. Modifiye edilen bitki türleri arasında çeltik, buğday, mısır, domates ve patates gibi önemli tarım ürünleri mevcuttur. CRISPR yoluyla ürünlerin kalitelerinin artırılmasına yönelik çalışmalar da mevcuttur. Meyve olgunlaşması ile ilgili olan RIN genin susturulması domateste raf ömrünü uzatmıştır.

CRISPR ve GDO

Türkiye’de yeni genom düzenleme teknikleriyle elde edilen bitki varyeteleri için özel bir mevzuat henüz mevcut değildir. ZFN, TALEN ve CRISPR ile elde edilen bitkilerin üretimi, salınımı ve kullanımı tıpkı GDO’larda olduğu gibi 13 Ağustos 2010 tarihli Resmi Gazete de yayınlanan “Genetik Yapısı Değiştirilmiş Organizmalar ve Ürünlerine Dair Yönetmelik” ile düzenlenmektedir. Bu haliyle Türkiye’ deki uygulama, ilk yaklaşım şeklindeki düzenlemeyle ve dolayısıyla AB ile paralellik arz etmektedir.

ZFN, TALEN ve CRISPR Sistemlerinin Karşılaştırılması

CRISPR ile kıyaslandığında, ZFN ve TALEN’ leri dizayn etmek ve hazırlamak hem zor hem zaman alıcıdır. Maliyetlerine bakıldığında ZFN ve TALEN sistemleri CRISPR sistemine göre daha pahalıdır.