Biyoinformatik dünyasına kaliteli, özgün ve Türkçe içerikler kazandırmayı hedefleyen bir platform..

DNA Dizileme(sekanslama) Nedir? DNA dizilemeye neden ihtiyaç duyarız?

DNA dizilemede ki amaç varyasyonları yani mutasyonları ve polimorfizmleri yani nükleotid değişikliklerini görmektir.

1. Maxam-Gilbert Yöntemi
2. Sanger Yöntemi
3. NGS

1- Maxam-Gilbert Yöntemi

Maxam-Gilbert Yöntemi, Sanger yöntemi ile aynı dönemde bulunmuştur(1977) fakat kimyasal ve kanserojen maddeler kullanıldığından dolayı ayrıca uygulaması zor olduğu için tutulmamıştır.

2- Sanger Sekanslama Yöntemi (dideoksi)

Sanger metodu, zincir sonlandırma metodu olarak da adlandırılır. İlk çıkan sekanslama yöntemlerinden birisi Sanger Sekanslama yöntemidir. Halen daha %99.99 doğrulukla altın standart olarak bu yöntem kullanılmaktadır. Eğer PCR'da hata yapılmazsa(kullanıcı hatası) neredeyse hatasız çalışan bir yöntemdir. Hatta NGS(Yeni Nesil Sekanslama) sonuçları da bu yöntem ile doğrulanmaktadır.

Sanger dizileme, 1977'de Frederick Sanger ve arkadaşları tarafından geliştirilen, 1980'lerden itibaren kullanılan ve kendini geliştiren bir yöntemdir. Bu yöntem ilk çıktığında otomatik değildi daha sonra otomatikleştirildi. Frederick Sanger, DNA dizileme metotlarına yaptığı büyük katkılardan dolayı 1980 Nobel Kimya Ödülü'nü de kazandı. İnsan genom projesi Sanger dizileme yöntemi ile yapılmıştır(Bu dönemde henüz NGS geliştirilmemişti). Sanger dizileme yönteminde tüm genom değil DNA'nın istenilen bir bölgesinin kopyaları üzerinde dizileme yapılabilir.

Dizi sonlandırma metodu olarak da bilinir. Yöntemde modifiye edilmiş nükleotidler kullanılmaktadır. Normalde 3' ucunda OH^- bulununca Fosfat ile bağlanma olurken, OH^- yerine H koyunca, bir sonraki nükleotid buraya bağlanamaz ve zincir sonlanmış olur. Sanger dizileme ile ilk insan genomu dizilemesi 13 sene sürmüştür(1990-2003) ve 3 milyar $ tutmuştur. Ancak NGS ile insan genomu yaklaşık 2 hafta gibi bir kısa sürede tamamlanmaktadır ve ortalama 1.000$ tutmaktadır.

Örneğin bilinen bir genetik hastalık üzerinde çalışacaksak ve sadece bilinen bir genin dizisini çıkarmak yeterliyse tüm genomu dizilemeye gerek yoktur. Kısaca hedef belli olduğu için önce DNA'yı izole ediyoruz. Ardından PCR yaparak DNA'yı çoğaltıyoruz(temel PCR basamakları), daha sonra Jel Elektroforezi ve bilgisayarda değerlendirme işlemleri.

PCR için; kalıp DNA, primerler, DNA polimeraz(Taq Polimeraz enzimi), dNTP(deoksinükleotid) ve ddNTP(dideoksinükleotid ) gereklidir. ddNTP'ler farklı florasan boyalarla işaretlenmişlerdir. dNTP ve ddNTP arasındaki fark: dNTP 3' ucunda OH varken ddNTP'de H vardır.

3- NGS(Next Generation Sequencing)

Genel olarak, milyonlarca eş zamanlı olarak gerçekleşen dizileme reaksiyonları sonucu yüksek çıktılı veri elde edilmesidir. NGS(Yeni Nesil Dizileme) aslında birkaç yöntemin adıdır. NGS yöntemlerinden bazıları:

Whole Genome Sequencing

Bazı durumlarda, hedef belli olmayabilir ya da hastalık bilinen bir hastalık olmayabilir. Bu gibi durumlarda bakacağımız gen belli olmadığı için genomun tamamını dizilemek isteriz. Genler, intergenik bölgeler, mitokondriyal DNA (mtDNA) kısaca ne var ne yok dizileriz.

Whole Exome Sequencing

Zaten kalıtsal bir hastalığa bakıyor olabilirsiniz, dolayısıyla bütün genoma ihtiyacınız yok. Sadece kodlayan bölgeler yeterli(hastalıkların çoğu bu kısımlardan kaynaklı, intergenik bölgelerin ise hastalık yapma ihtimali çok düşük), yani ekzonların tamamı ve intronların ise sadece başları ve sonları alınır. Ayrıca genomun tamamını değil de sadece kodlayan bölgeleri almamız zaman ve maliyet açısından da oldukça avantajlı bir durumdur.

Panel Sequencing

Sadece elimizdeki listeye göre gen bakıyorsak örneğin sadece metabolik hastalıklarla ilgili genlere ya da kanser genlerine bakıyorsak bu yöntemi kullanırız. Sadece kanser genlerine bakıyorsak hastanın diğer genleri bizi ilgilendirmez. Bu şekilde genlerin sayısı azaldığından daha düşük maliyet gerekir hem de analiz edilecek daha az veri ile uğraşırız.

Transcriptome Sequencing

Hedef DNA değil RNA'dır. RNA'nın tamamı ya da belirli bir grup RNA olabilir(mRNA). Burada ki amacımız gen ekspresyonuna bakmaktır. Burada önce RNA izole edilir ve ardından cDNA'ya çevrilir. Son olarak bu kopyalara RNA sequencing uygulanır. Hangi dokudan RNA izole edildiyse sadece o genlerin ekspresyonu gözlenir.

NGS Basamakları

1. Dizilenecek olan DNA ilk önce parçalara ayrılarak(DNA Fragments) bir veri oluşturulur.
2. Daha sonra bu parçaların uçlarına adaptör dizileri ve barkod dizileri eklenir.
3. Adaptör dizileriyle katı yüzeye(ince kılcal damarlar-flow cell) tutturulmuş olan tek zincir halindeki DNA parçalarına işaretli bazlar eklenerek diğer zincirin sentezi gerçekleştirilir.
4. Her yeni bazın eklenmesi ile ortaya çıkan ışık, pH veya iyon dengesinin değişimi nedeniyle kimyasal ve foto-sensörler hangi bazın eklendiği belirlenmekte ve kaydedilmektedir.